單克隆抗體的制備

單克隆抗體和多克隆抗體有什么區別?

單克隆抗體由同一株B細胞克隆分泌，編碼該抗體的基因序列*一致。只識別單一抗原表位。

多克隆抗體則是混合體，有動物體內所有可識別該抗原的B細胞分泌?？勺R別該抗原上的不同抗

原表位。

單克隆抗體的優點與局限性：單克隆抗體和多克隆抗體各有其優點和局限性，只有對它們有全面

的了解，才能根據不同應用領域的要求，正確的選擇和應用。

  1）單克隆抗體的優點：

  （1）雜交瘤可以在體外“*”地存活并傳代，只要不發生細胞株的基因突變，就可以不斷

的生產高特異性、高均一性的抗體。

  （2）可以用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。

  （3）由于可能得到“無*”的均一性抗體，所以適用于以標記抗體為特點的免疫學分析方

法，如IRMA和ELISA等。

  （4）由于單克隆抗體的高特異性和單一生物學功能，可用于體內的放射免疫顯像和免疫導向

治療。

  2）單克隆抗體的局限性：

  (1）單克隆抗體固定的親和性和局限的生物活性限制了它的應用范圍。由于單克隆抗體不能進

行沉淀和凝集反應，所以很多檢測方法不能用單克隆抗體完成。、

  (2)單克隆抗體的反應強度不如多克隆抗體。

  （3）制備技術復雜，而且費時費工，所以單克隆抗體的價格也較高。

單克隆抗體的制備過程

過程

1）免疫脾細胞的制備 制備單克隆抗體的動物多采用純系 Balb/c小鼠。免疫的方法取決于所用

抗原的性質。免疫方法同一般血清的制備，也可采用脾內直接免疫法。

  2）骨髓瘤細胞的培養與篩選 在融合前，骨髓瘤細胞應經過含8-AG的培養基篩選，防止細胞發

生突變恢復HGPRT的活性（恢復HGPRT的活性的細胞不能在含8-AG的培養基中存活）。骨髓瘤

細胞用10%小牛血清的培養液在細胞培養瓶中培養，融合前24h換液一次，使骨髓瘤細胞處于對

數生長期。

  3）細胞融合的關鍵:

 1技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如，供者淋巴細胞沒有查到免疫應答。這必然要失敗的

 2融合試驗zui大的失敗原因是污染，融合成功的關鍵是提供一個干凈的環境，以及適宜的無菌操

作技術。

  4）陽性克隆的篩選 應盡早進行。通常在融合后10天作*次檢測，過早容易出現假陽性。檢

測方法應靈敏、準確、而且簡便快速。具體應用的方法應根據抗原的性質，以及所需單克隆抗體

的功能進行選擇。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫熒光法等。其中ELISA法zui簡便，RIA

法zui準確。陽性克隆的篩選應進行多次，均陽性時才確定為陽性克隆進行擴增。

  5）克隆化 克隆化的目的是為了獲得單一細胞系的群體?？寺』瘧M早進行并反復篩選。這是

因為初期的雜交瘤細胞是不穩定的，有丟失染色體的傾向。反復克隆化后可獲得穩定的雜交瘤細

胞株?？寺』姆椒ê芏?，而zui常用的是有限稀釋法。

（1）顯微操作法：在顯微鏡下取單細胞，然后進行單細胞培養。這種方法操作復雜，效率低，

故不常用。

（2）有限稀釋法：將對數生長期的雜交瘤細胞用培養液作一定的稀釋后，按每孔1個細胞接種

在培養皿中，細胞增值后成為單克隆細胞系。*次克隆化時加一定量的飼養細胞。由于*次

克隆化生長的細胞不能保證單克隆化，所以為獲得穩定的單克隆細胞株需經2～3次的再克隆才

成。應該注意的是，每次克隆化過程中所有有意義的細胞都應冷凍保存，以便重復檢查，避免丟

失有意義的細胞。

（3）軟瓊脂法：將雜交瘤細胞稀釋到一定密度，然后與瓊脂混懸。在瓊脂中的細胞不能自由移

動，彼此互不相混，從而達到單細胞培養的目的。但此法不如有限稀釋法好。

（4）熒光激光細胞分類法：用抗原包被的熒光乳膠微球標記雜交瘤細胞，然后根據抗原與雜交

瘤細胞結合的特異性選出細胞，并進行單細胞培養。

6）細胞的凍存與復蘇

7）大規模單克隆抗體的制備   選出的陽性細胞株應及早進行抗體制備，因為融合細胞隨培養時

間延長，發生污染、染包體丟失和細胞死亡的機率增加?？贵w制備有兩種方法。一是增量培養法

，即將雜交瘤細胞在體外培養，在培養液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設備，一般應

用無血清培養基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。zui普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用

BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細胞接種

到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有

時甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達數毫克甚至數十毫克水平。此外，

腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。

意義：

用于以下各種生命科學實驗并具有醫用價值

（1）沉淀反應：Precipitation reaction

（2）凝集實驗：haemaglutination

 （3）放射免疫學方法檢測免疫復合物

（4） 流式細胞儀：用于細胞的分型和細胞分離。

（5）ELISA 等免疫學檢測

（6）BIAcore biosensor:檢測Ab-Ag或與蛋白的

     親和力 。

  (7) 免疫印記（western blotting)

（8） 免疫沉淀：

（9） 親和層析：分離蛋白質

（10） 磁珠分離細胞

（11）臨床疾病的診斷和治療

原理：

B淋巴細胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力。B

細胞的這種能力和量是有限的，不可能持續分化增殖下去，因此產生免疫球蛋白的能力也是極其

微小的。將這種B細胞與非分泌型的骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞，再進一步克隆化，這種克

隆化的雜交瘤細胞是既具有瘤的無限生長的能力，又具有產生特異性抗體的B淋巴細胞的能力，

將這種克隆化的雜交瘤細胞進行培養或注入小鼠體內即可獲得大量的價、單一的特異性抗體

。這種技術即稱為單克隆抗體技術。

依據原理：細胞的性。

離體的植物器官、組織或細胞，在培養了一段時間后，會通過細胞分裂，形成愈傷組織。由高度

分化的植物器官、組織或細胞產生愈傷組織的過程，稱為植物細胞的脫分化，或者叫做去分化。

脫分化產生的愈傷組織繼續進行培養，又可以重新分化成根或芽等器官，這個過程叫做再分化。

再分化形成的試管苗，移栽到地里，可以發育成完整的植物體。

★愈傷組織（Callus）：原指植物在受傷之后于傷口表面形成的一團薄壁細胞，在組培中則指人

工培養基上由外植體長出來的一團無序生長的薄壁細胞。

★脫分化（dedifferentiation）：在組織培養中，不分裂的靜止細胞，放在一定的培養基上后，

細胞重新進入分裂狀態。一個成熟的細胞轉變為分生狀態的過程叫脫分化。

  ★再分化（redifferentiation）：一個成熟的植物細胞經歷了脫分化后，能再分化而形成完整

植株的過程。

  ★再分化途徑：1、器官發生方式（是指在外植體或愈傷組織的不同部位分別獨立形成莖、芽和

根，它們為單極性結構，各有維管束與外植體或愈傷組織相連，但在不定芽和不定根之間沒有共

同的維管束將兩者連在一起。）2、胚胎發生方式（外植體直接或通過愈傷組織或懸浮培養產生

胚狀體。）

  ★胚狀體（embryoid）：是指在組織培養中起源于一個非合子細胞，經過胚胎發生和胚胎發育

過程形成的具有雙極性的胚狀結構。其特點有：1、不同于合子胚，因為它不是兩性細胞融合產

生。2、不同于孤雌/雄胚，因為它不是無融合生殖的產物。3、不同于器官發生方式形成的莖芽

和根，因為它經歷了與合子胚相似的發育過程且成熟的胚狀體是雙極性結構。

  ★器官發生途徑：1、莖尖或莖段培養產生腋芽。2、直接不定芽發生：器官的小塊組織在培養

基上培養直接誘導產生不定芽。3、間接不定芽發生：器官的小塊組織在培養基上培養后先去分

化形成愈傷組織，再經分化誘導產生不定芽或不定根。

  ★胚胎發生方式：1、直接胚胎發生（從培養物中的器官組織，細胞或原生質體直接分化成胚，

中間不經過愈傷組織）2、間接胚胎發生（外植體先愈傷化，然后由愈傷組織細胞分化成熟）

  球型胚（globalembryo）→心型胚（heart-stageembryo）→雷型胚（torpedo-

stageembryo）→子葉型胚（cytoledon-stageembryo）

  ★人工種子：是指利用細胞的性將離體培養所產生的體細胞或具有發育成完整植株能力的

分生組織（胚狀體，莖和莖段）包裹在一層含有營養物質并具有保護功能的外膜內形成在適宜條

件下能夠發育成完整植株的小顆粒。

  結構包括人工種皮，胚狀體（分生組織），人工胚乳。

 ★花粉花藥培養的意義：1、在單倍體細胞中只有一個染色體組，表現型和基因型一致，一旦發

生突變，無論是顯性還是隱性，在當代就可表現出來，因此單倍體是體細胞遺傳研究和突變育種

的理想材料。2、在品種間雜交育種過程中，通過F1代花藥培養得到單倍體后，經染色體加倍立

即成為純合二倍體，從雜交到獲得不分離的雜種后代單株只需要2個世代和常規育種相比，顯著

縮短了育種年限。

  ★花藥培養步驟（用改良的NLN培養基）：

  F1代花藥→形成小孢子→分離小孢子→形成愈傷組織→形成胚→單倍體植株→純合二倍體

  ↓

  形成胚→單倍體植株→染色體加倍形成純合二倍體

  ★植物組織培養應用步驟：1、獲得無菌外植體，建立起無菌培養體系。2、進行增殖，不斷產

生不定芽或胚狀體。3、生根培養。4、試管苗移栽。

  ★外植體選擇的原則：1、必須含有活細胞。2、幼嫩組織所含活躍分裂的細胞比例高。3、母

珠必須健康并且無任何腐爛或生病的跡象。4、母珠必須活躍生長并且不會立即進入休眠。

  ★外植體的確定選擇：1、莖尖（園藝植物組織培養中應用zui多，繁殖率高，不易發生遺傳變異

，但取材有限）；2、莖段（采用嫩莖的切段促進腋芽萌發，取材容易）；3、葉（幼嫩葉片組

織通過愈傷組織或不定芽分化產生植株，取材容易，操作方便，但易發生變異）；4、花球和花

蕾；5、種子、根、塊根、塊莖、花瓣等。